تشخیص همزمان ویروس های مهم سیب زمینی با استفاده روش multiplex rt-pcr

سیب زمینی با نام علمی (solanum tuberosum l.)، از نظر اهمیت غذایی و اقتصادی بعد از محصولاتی چون گندم، برنج، ذرت و جو در رتبه پنجم قرار دارد. بیماری های ویروسی از مهم ترین عوامل خسارت زای سیب زمینی در جهان و ایران محسوب می شوند. ویروس های آلوده کننده سیب زمینی از جمله ویروس وای سیب زمینی، پیچیدگی برگ سیب زمینی ، اس سیب زمینی و موزاییک یونجه در مناطق مهم سیب زمینی کاری دنیا، خسارات شدید اقتصادی را وارد می کنند. استان اصفهان و چهار محال و بختیاری از مناطق عمده کشت سیب زمینی در ایران به شمار می روند و ویروس های مزبور در این مزارع شیوع گسترده ای دارند. هر چند تاکنون روش های مختلفی برای تشخیص عوامل ویروسی سیب زمینی ارائه شده است، ولی امروزه روش واکنش زنجیره ای پلی مراز (pcr) به عنوان روشی حساس، سریع و آسان کارایی بسیار بالایی در تشخیص این ویروس ها دارد. ویژگی منحصر به فرد این روش در تشخیص همزمان چند ویروس(multiplex rt-pcr) باعث کاهش هزینه ها و زمان آزمایش می گردد. با توجه به بالا بودن میزان آلودگی مزارع سیب زمینی به ویروس در ایران و نیاز کشور به تولید غده های بذری سالم و عاری از ویروس ها، طراحی و بهینه سازی multiplex rt-pcr جهت ردیابی همزمان ویروس های مهم سیب زمینی از نیازهای ضروری آزمایشگاه های تحقیقاتی و کلینیک-های تشخیص بیمار ی های گیاهی می باشد. به این منظور، در این تحقیق ردیابی همزمان pvy، pvs، plrv و amv از غده های سیب زمینی مزارع اصفهان و چهارمحال و بختیاری به روش multiplex rt-pcr مورد توجه قرار گرفت. نمونه برداری از مناطق سیب زمینی کاری استان اصفهان )چادگان، داران، دامنه، فریدن و فریدون شهر( و در استان چهارمحال و بختیاری )بروجن و فرادنبه( از بوته های سیب زمینی واجد علایم ویروسی موزاییک، پیچیدگی برگ ، راست ایستادن بوته و لکه های زرد روشن(calico) انجام گرفت. همچنین از نمونه های موجود در گلخانه دانشگاه صنعتی اصفهان نیز استفاده شد. استخراجtotal rna هر یک از نمونه ها به طور جداگانه از برگ گیاهان دارای علایم ویروسی طبق روش کانونتاپیپت و همکاران انجام شد. ساخت cdna و انجام واکنش pcr به کمک آغازگرهای هر ویروس به صورت جداگانه، ترکیب دوتایی و مخلوط هر چهار ویروس انجام شد. بهینه سازی واکنش multiplex rt-pcr با اعمال تغییرات در غلطت آغازگرها، کلرید منیزیم و دمای اتصال آغازگر ها انجام شد. ردیابی همزمان pvy، pvs، plrv و amv همراه با 18s rrna به عنوان کنترل داخلی ابتدا با استفاده از روش duplex rt-pcr به صورت دو به دو سپس با استفاده از روش multiplex rt-pcr به صورت چهارتایی با استفاده از جفت آغازگرهای (pvycpcecorii/pvycpvbamhi، plrv-fkhr/plrv-fkhf، pvs-r/pvs-f و amv-r/amv-f) و آغازگر 18s rrna-r/18s rrna-f به عنوان کنترل داخلی به طور همزمان انجام شد. نتایج نشان داد که جفت آغازگر pvycpcecorii/pvycpvbamhiباند bp801، جفت آغازگر pvs-r/pvs-f باند bp684، جفت آغازگر amv-r/amv-fباند bp415، جفت آغازگر plrv-fkhr/plrv-fkhf باندbp 336 و جفت آغازگر 18s rrna-r/18s rrna-f باند bp 255 را به عنوان کنترل داخلی تکثیر کردند. همچنین با بهینه سازی و انجام تغییرات در مقدار غلظت کلرید منیزیم، آغازگرها، زمان گسترش و دمای اتصال آغازگرها، چهار ویروس pvy، pvs، plrv و amv به همراه 18s rrna با موفقیت ردیابی شدند. به این ترتیب معلوم شد که می توان از روش بهینه سازی شده multiplex rt-pcr به عنوان روشی حساس، دقیق، سریع و قابل اعتماد در ردیابی همزمان ویروس های مهم سیب زمینی استفاده نمود